湿热灭菌微生物挑战实验一般和热穿透同时进行，生物指示剂挑战测试主要目的是获取所要验证的灭菌程序杀灭微生物的实际数据，从而证明所建立的灭菌程序达到了程序设计中建立的生物杀灭时间(F_BIO)。生物指示剂挑战测试一般需要注意以下几点：所选用生物指示剂的数量应比装载物品的生物负荷高，生物指示剂应尽可能靠近温度探头的放置部位。

可以一起做，指示剂是放置位置至少包含冷点，其他的点可以根据实际情况摆放。

可以一起执行。微生物挑战测试和热穿透是使用生物的方法和物理的方法确认达到灭菌条件，是两个不同的维度。GMP指南中对此说明如下：

在灭菌工艺验证中，是可以同时进行热分布（穿透）试验和微生物挑战试验，对于一个灭菌程序而言，当一个生物指示剂的生物杀灭时间可测量时，在同一位置测得的物理杀灭时间和生物杀灭时间应该是相等的。

一般都是一起进行的，想省指示剂，就在热分布时确定时冷点，热穿透就可以只在冷点放。