强制降解试验研究是药品质量研究中不可或缺的一部分，我查阅文献、相关技术指南，结合工作实践对强制降解试验技术要求进行了总结归纳，供大家学习参考，不尽之处也请指正！

一、强制降解试验一般描述或定义

目前ICH Q1等指导原则对强制降解试验均进行了比较详实的描述，总结如下：

1、ICH Q1A ：StabilityTesting on New Drug Substance and Drug Products

对于“stress testing” 的描述是：

•       Stress testing of the drug substance can help identify the likely degradation products, which can in turn help establish the degradation pathways and the intrinsic stability of the molecule and validate the stability indicating power of the analytical procedures used.

•       Stress testing is likely to be carried out on a single batch of the drug substance.

•       It should include the effect of temperatures (in 10°C increments (e.g., 50°C, 60°C, etc.) above that for accelerated testing), humidity (e.g., 75% RH or greater) where appropriate, oxidation, and photolysis on the drug substance.

•       The testing should also evaluate the susceptibility of the drug substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension.

•       It may not be necessary to examine specifically for certain degradation products if it has been demonstrated that they are not formed under accelerated or long term storage conditions.

•       Results from these studies will form an integral part of the information provided to regulatory authorities.

2、ICH Q1B : Photostability Testingof New Drug Substances and Products

对于“forced degradation testing” 的描述为：

•       强制降解试验是光稳定性试验的其中一部分，而光稳定性试验是强力试验（stress testing）的一部分。

•       The purpose of forced degradation testing studies is to evaluate the overall photosensitivity of the material for method development purposes and/or degradation pathway elucidation.

3、ICH Q2(R1) : Validation of AnalyticalProcedures

•       Stress conditions: light, heat, humidity, acid/base hydrolysis and oxidation.

•       Specificity - Assay and Impurity Test(s) - Impurities are not available

注：EMA、 WHO发布的稳定性指南中用词均为“stress testing”。

4、化学药物（原料药和制剂）稳定性研究技术指导原则：

影响因素试验（2015年定稿中对应英文是为“stress testing”）

•       主要是考察原料药和制剂对光、湿、热、酸、碱、氧化等的稳定性

•       了解其对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性，主要的降解途径及降解产物

•       并据此为进一步验证所用分析方法的专属性、确定加速试验的放置条件及选择合适的包装材料提供参考。

5、2020版中国药典 9001 原料药物与制剂稳定性试验指导原则

影响因素试验（2015版对应英文翻译为“Affecting factor testing”）：

•       在比加速试验更激烈的条件下进行，目的是探讨药物的固有稳定性，了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。

•       将供试品置适宜的开口容器中（如称量瓶或培养皿），分散放置，厚度不超过3mm(疏松原料药可略厚）。

•       当试验结果发现降解产物有明显的变化，应考虑其潜在的危害性，必要时应对降解产物进行定性或定量分析。

•       包括高温试验、高湿试验、强光照射试验。

•       根据药物的性质必要时可设计试验，原料药在溶液或混悬液状态时，或在较宽pH值范围探讨pH值与氧及其他条件应考察对药物稳定性的影响，并研究分解产物的分析方法。

•       创新药物应对分解产物的性质进行必要的分析。

•       冷冻保存的原料药物，应验证其在多次反复冻融条件下产品质量的变化情况。

•       在加速或长期放置条件下已证明某些降解产物并不形成，则可不必再做降解产物检查。

二、强制降解试验——目的

强制降解试验目的主要包括如下几个方面：

•       建立原料药和制剂的降解途径

•       区分配方中与制剂相关和不相关的降解产物

•       阐明降解产物的结构

•       确定处方中原料药的内在稳定性

•       揭示原料药和制剂的水解、氧化、热解或光解等降解机制

•       建立稳定性指示方法

•       了解药物分子的化学性质

•       确定更加稳定的处方

•       产生一个与ICH正式稳定性试验相似的降解杂质谱

•       解决稳定性试验中有关的问题

三、强制降解试验——条件设计与降解量

典型的强制降解主要包括：高温、高湿、光、氧化以及酸和碱。

降解量

Ø  在色谱分析方法中一般认为降解5%-20%是合理的，对于分析方法验证来说降解10%为最优。

Ø  有些科学家认为对于含量下限为90%的小分子药物来讲10%的降解程度是最佳的。

Ø  如果物质在任何应力条件下没有表现出任何降解，则应重复应力研究以获得足够的降解。如果不能实现降解，应提供理由。

Ø  推荐最长为7-14天的降解试验。

Ø  由于制剂中的辅料和主药浓度与API不同，因此制剂的产生降解杂质的方案可能与API是不同的。

对于降解量，请注意，强制降解试验研究试验中降解量是针对主成分而言的，笔者和同行交流了解到，部分分析人员在计算降解量时是按有关物质项下降解后的杂质总量减降解前杂质总量计算的。

这种处理方式，笔者认为是不严谨的，例如主成分降解量达到10%的时候，药物达到了预期的降解程度。但是杂质检出总量为10%的时候主成分却不一定达到了预期的降解程度。会出现过度破坏或者破坏不足的情况。杂质会在破坏条件下二级降解甚至三级降解的。所得降解产物可能检不出来；也可能都检出来且检出结果远超降解前含量。

样品浓度

Ø  目前指导原则中没有规定。文献推荐采用1mg/ml作为起始研究浓度。

Ø  有些降解研究建议在最终处方浓度下进行。如氨基青霉素和氨基头孢菌素在最终商业处方中浓度很高，会产生一系列的聚合物杂质。

1、热稳定性

热破坏试验条件（例如：干热破坏和湿热破 ）

•       应比ICH Q1A中推荐的加速试验条件剧烈。

Ø  建议破坏温度应高于加速试验温度的10℃

Ø  相对湿度为75%或者更高

•       固体原料药和制剂应同时暴露于干热和湿热条件下，液体制剂可以暴露于干热条件下。

•       也可以在更高温度条件下进行短时间破坏。对破坏样品进行多个时间点检测，能够充分提供降解速率、一级与二级降解产物的信息。

注意：药物较稳定（产生较少降解产物或无降解产物产生）：应确保破坏强度高于在加速条件下（40℃）放置6个月的破坏强度。

使用阿伦尼乌斯（Arrhenius）动力学假设，典型的降解的相对速率因素（相对于25℃）

Ø  推荐的活化能假设（15kcal/mol）

假设活化能(Ea)为15kcal/mol，在25℃储存18个月，例如，通过在70℃储存20天来模拟（因为20×27.7=554天，约18个月），或在90℃储存6天、在110℃储存2天模拟。

Ø  保守假设

假设活化能为12kcal/mol，在25℃储存18个月通过在70℃储存39天来模拟（因为39×14.2=554天，约18个月），或在100℃储存9天模拟。

Ø  激进假设

假设活化能为18kcal/mol，在25℃储存18个月通过在70℃储存10天或在90℃储存2.5天模拟（因为2.5×231=578天，约18个月）。

2、光稳定性

ICH Q1B：

•       提出了新原料药和制剂的光稳定性试验条件，也列出的决策树可以用来确定药物的光稳定性试验条件。

•       光源：应对温度进行适当的控制，以减少局部环境温度变化对试验的影响，或在相同环境中增加暗度控制样品（避光对照），以下光源可选

选项1：

采用任何输出相似于D65/ID65发射标准的光源，如具有可见-紫外输出的人造日光荧光灯、氙灯或金属卤化物灯。D65是国际认可的室外日光标准[ISO 10977(1993)]。ID65相当于室内间接日光标准。若光源发射光低于320nm，应滤光除去。

选项 2：

相同的样品应同时暴露于冷白荧光灯和近紫外灯下。

1）冷白荧光灯应具有ISO10977(1993)所规定的类似输出功率。

2）近紫外荧光灯应具有320～400nm的光谱范围，并在350～370nm有最大发射能量；在320～360nm及360～400nm二个谱带范围的紫外光均应占有显著的比例。

原料药、固体/液体制剂：

•       总照度不低于1.2×106 Lux •hr

•       近紫外能量不低于200w•hr/ m2

•       相同样品应同时暴露在日光灯和近紫外灯下

•       可控制合适的温度以减少局部温度变化效应。

注意：

•       光破坏样品要检查样品是否有物理性质（如外观、溶液的颜色或澄清度）、含量和降解产物的变化。

•       羰基、硝基芳烃、N-氧化物、烯烃、芳基氯化物、弱C–H和O–H键、硫化物和多烯可能产生药物的光敏性。

3、酸碱水解

•       原料药与制剂应在常温或更高温度条件下，以溶液状态进行酸碱水解破坏试验，

•       酸碱种类和浓度：取决于药物本身的特点。

Ø  一个化合物含有酯基，则它对碱是不稳定的，则可选择较低浓度的碱进行破坏。

•       其中一种酸碱破坏试验方案为：

Ø  样品于室温条件下放置，在不同pH条件下破坏两周，且破坏程度建议应不高于15%。

•       酸降解：0.1mol/L-1.0mol/ L的盐酸或硫酸

•       碱降解：0.1mol/L-1.0mol/ L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液

•       脂溶性药物：可选择惰性溶剂溶解药物，在选择助溶剂时，应考虑药物分子中存在的官能团不与助溶剂发生反应。

4、氧化破坏

•       过氧化氢应用较广泛

•       氧化剂种类和浓度的选择取决于药物本身的性质。

Ø  原料药在溶液状态下，制剂在溶液或固体状态下进行氧化破坏。

Ø  文献：样品放置于室温，在中性条件下经浓度为0.1-3%的过氧化氢破坏7天，最多能产生20%的降解产物。

•       在不同时间点对样品进行测定，以选择所需的降解水平。

•       不同的降解条件会产生相同或不同的降解产物。

•       降解的类型和程度取决于样品的官能团和降解条件。

Ø  胺、硫化物和苯酚易受电子转移氧化产生N -氧化物、羟胺、砜和亚砜。

Ø  不稳定氢如苄基碳、烯丙基碳、和叔碳或α-位氢原子容易氧化形成氢过氧化物、羟基或酮。

4、原料药和制剂降解条件-常用试验方案

l  酸/碱水解

l  氧化降解

Ø  原料药

Ø  制剂

l  光降解

原料药和制剂

l  热/湿降解

原料药和制剂

5、强制降解试验——试验方法

分析方法

•       首选检测方法是反相高效液相色谱法，原因：

Ø  与水和有机溶剂具体良好的相容性，准确度好，灵敏度高，能够检测极性化合物。

Ø  通过选择合适的色谱柱、柱温，调节流动相的pH值，从而达到各峰的分离。

•       破坏样品的制备方法应尽可能地模拟分析过程中所用的样品制备方法。

•       对酸碱破坏样品溶液进行酸碱中和稀释是必要的。

•       破坏样品的图谱应与空白溶液和未破坏样品的图谱进行对比，从而确定各降解产物的降解途径。

•       计算时，应扣除空白峰。

•       应提供在每种降解条件下获得的杂质量（已知和未知），以及空白、未破坏和破坏样品的色谱图（显示所有峰的全刻度和放大刻度）。

•       手性化合物应该用手性分析手段来确定手性化合物的纯度和稳定性。

•       分析方法应有足够的灵敏度以检测出较低水平的杂质，（例如，应检测出0.05%浓度的杂质或者更低浓度的杂质），并且峰响应值应在线性范围内的峰响应值以下。

•       分析方法应能检测到稳定性研究过程中产生的所有杂质（浓度为报告限度浓度或更低 ）。

•       对在稳定性研究过程中产生的超过界定阈值限度的杂质应进行界定。

•       可以用不同的检测方法对各破坏样品进行检测（例如紫外和质谱），所用的检测器应具有三维数据分析的能力，例如，二极管阵列检测器或质谱分析能够检测到光谱的非均匀性。

•       当主峰和杂质峰紫外吸收图谱相似或者系统噪音水平过高从而掩盖了杂质或降解产物时，二极管阵列检测器可进行多波长检测。

•       具有相同分子量和官能团的化合物（例如非对映异构体）会呈现出相似的紫外吸收图谱，需要改变色谱参数以实现色谱峰的分离。应选定最佳波长来检测和定量潜在杂质和降解杂质。

•       如果被分析物、杂质和降解产物紫外吸收没有重叠，则应对样品进行多波长检测。在方法开发时，应对汇总不同检测波长下杂质的信息以发现峰值分布的异同。

•        

峰纯度检测

•       未破坏样品和破坏样品的峰纯度或峰均匀性是根据二极管阵列检测器的光谱信息确立的。

•       用于确定峰光谱纯度的仪器软件，相关参数应按照生产厂商的说明书进行设置，并确定峰纯度检测时对色谱峰峰高的要求。

•       因为吸光度值过大，紫外检测呈非线性，应同时设置仪器阈值，以确保共洗脱峰均能被检出，并选择参比光谱的最佳位置。

•       在梯度洗脱过程中，应验证软件自动校正不断变化的溶剂峰的能力。峰纯度检测不是确定检测峰是否为纯峰的绝对证明，当共洗脱峰光谱相似、样品浓度低于检测限浓度、检测峰没有发色团，或者样品没有溶解的情况下，峰纯度检测具有一定的局限性。

质量守恒

•       尽管不是在所有的情况下，破坏样品均能达到质量平衡，但这种方法能使稳定性指示方法更加充分。

•       可以通过样品测量值、所有杂质和降解产物的测量值之和与未破坏样品初始值接近100%的程度来确定，在计算时适当考虑产生的分析误差。  

•       尽量使所有的破坏样品均达到质量守衡。

Ø  若样品质量不守衡，则应进行深入研究，并对这种情况给出说明。

•       由于被分析物和杂质紫外吸收情况有显著差异，应用外标法对样品进行检测。

•       挥发性杂质的潜在损失、非紫外吸收化合物的形成，不保留杂质，强保留杂质等情况都应被考虑在内。

•       交替检测技术，例如示差折光检测器与液质联用可以用来检测非紫外吸收的降解产物。

请注意：

1）回收率%=（破坏样品的含量+破坏样品杂质总量）/（未破坏样品的含量+未破坏样品杂质总量）

2）强制降解试验样品检测时，应使用质量标准中含量和杂质检测所涉及的所有方法分析相同样品以确认总体质量平衡。

6、强制降解试验——考察指标及推荐要求

仿制药研发中，通常采用强酸、强碱、强氧化、高温、强光方法加速对样品进行破坏试验，考察产品可能的降解途径、降解产物以及分析方法对产品潜在杂质的分离、检出能力，以评估分析方法的有效性和适用性。

仿制原料药推荐考察指标及要求范例如下所示：

7、美国仿制药申报常见缺陷——强制降解试验

1）  原料药在各破坏条件下均不产生降解。请重复破坏试验以获得足够的降解产物，若没有产生降解，请提供依据。

2）  破坏条件过于剧烈，导致大部分药物均被降解。请用温和的破坏条件或减少样品暴露时间以产生相关的降解产物。  

3）  请注意即使你已经用含量测定的方法对破坏的样品进行了检测，为了验证有关物质的检测方法具有稳定性指示功能，破坏的样品也应用有关物质的方法进行测定。

4）  请提供所做的验证试验数据，以证明用以检测未破坏样品和破坏样品的方法能够检测出所有的降解杂质。  

5）  请对破坏样品中已知和未知的降解产物进行列表总结。

6）  请确定检测软件对峰纯度检测的峰高要求。

7）  请说明破坏样品质量不守衡的理由。

8）  请鉴别原料药与辅料相互作用产生的降解产物。

9）  光稳定性研究表明药品对光敏感，请解释这一点是如何在分析方法，生产工艺以及药品运输过程反映出来的。

【主要参考文献】

1、ICHQ1A:Stability Testing of NewDrug Substances and Products

2、ICH Q1B: Photostability Testingof New Drug Substances and Products

3、ICH Q2: Validation of AnalyticalProcedures

4、化学药物（原料药和制剂）稳定性研究技术指导原则

5、2020版中国药典 9001 原料药物与制剂稳定性试验指导原则

6、Forced degradation studies for Drug Substances

7、FDA Perspectives-ScientificConsiderations of Forced Degradation Studies in ANDA Submissions

8、Practical and regulatory considerations for stability-indicating methods for the assay of bulk drugs and drug formulations

9、Development of forced degradation and stability indicating studies of drugs—A review

10、CDE电子刊物：杂质检查分析方法建立过程中破坏性试验的意义和存在的问题分析