环境监测 (EM) 对于确保洁净室环境保持最高清洁度标准并适合制造敏感产品至关重要，尤其是在制药、生物技术和电子等行业。

有效的监控不仅可以确保产品质量，而且在出现偏差或不合格时还可以作为关键的数据来源。

强大的环境监测计划应能深入了解洁净室中存在的微生物类型、它们的行为以及这些因素如何影响操作，例如消毒剂的选择。因此，识别活细菌和霉菌的能力对于防止污染和确保清洁方案的有效性至关重要。

本文深入探讨了 EM 的实用性，重点关注不同生物的生长模式、培养基类型以及培养条件的影响。我们将探讨常见洁净室污染物的生长特性，并讨论形态在各种培养基上如何随时间变化。

了解这些原则对于优化微生物回收率和确保洁净室环境保持受控至关重要。

环境监测在洁净室中的作用

洁净室的环境监测主要关注活细菌和真菌，确保微生物负荷保持在可接受的限度内

收集的数据对于产品的发布起着关键作用，因为洁净室必须保持无污染，以避免产品质量受到影响。当出现偏差或不符合情况时，EM 数据可作为参考点，让微生物学家和质量控制 (QC) 人员调查污染源、消毒剂的有效性以及环境的整体卫生状况。

洁净室监测中使用的每一种方法——收集空气样本、表面拭子和沉降皿——都有助于通过强调趋势和识别潜在污染源来建立洁净室环境的全面概况。

这些微生物概况通常针对单个洁净室，考虑到所进行的活动、存在的材料，甚至空间内操作人员等因素。因此，定期审查和更新监测策略以反映洁净室操作或布局的任何变化至关重要。

了解通过 EM 分离的生物类型是关键。例如，经常遇到金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和曲霉菌等常见污染物。通过研究这些生物的生长模式以及它们如何根据培养条件和培养基类型发生变化，QC 人员可以就污染控制和根本原因分析做出更明智的决策。

形态和培养时间：案例研究

我们以革兰氏阳性球菌表皮葡萄球菌为例。

在 30-35°C 的温度下，在胰蛋白酶大豆琼脂 (TSA) 上培养 24 小时后，其菌落看起来小而光滑，形状规则。这使得区分可能存在于平板上的其他细菌变得困难。然而，再培养 24 小时后，菌落变得更加明显，表现出典型特征，例如尺寸更大和形态典型（图 1）。 

图 1：培养板 - 表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌

因此，培养时间对菌落外观有显著影响。另一个例子是表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌——虽然属于同一属——但在30–35°C 下培养 48 小时后，可以通过它们的色素沉着来区分。 

随着时间的推移，这种视觉差异变得更加明显，两种物种在五天时表现出相似的生长模式，但具有足够的特征差异以实现准确识别。形态学是微生物鉴定的关键部分，无论是与传统表型测试结合使用还是与鉴定平台一起使用。 

霉菌遍布培养皿，使得记录细菌数量和鉴定细菌变得更加困难

这表明培养时间和温度对于有效细菌鉴定至关重要。必须注意的是，如果由于调查需要频繁检查培养皿，则读取 24 小时培养皿可能会导致错误鉴定或不准确的结果。了解哪些微生物在 48 小时以上表现更好，可以提供更清晰、更准确的结果——这是 QC 人员应将其作为监测方案的一部分来理解的做法。

培养基对形态的影响

在洁净室中，培养基的选择对于污染物的回收起着至关重要的作用。TSA 是一种常用的介质，但当加入卵磷脂和吐温等其他成分时，它们会影响回收细菌的形态。

例如，在含有卵磷脂和吐温的 TSA 上培养 24 小时和 48 小时的金黄色葡萄球菌，其形态与未添加任何添加剂的 TSA 相似。然而，到第五天，培养基添加剂会引起形态变化，从而使表型鉴定变得复杂（图2）。这强调了了解培养基对微生物生长的影响的重要性。

图 2a - 培养皿 - 金黄色葡萄球菌 TSA L + T 24 小时 

图 2b 培养皿 - 金黄色葡萄球菌 TSA L + T 5 天

双重培养制度及其影响

通常会实施双重培养方案，以减少对额外 EM 板的需求。首先将一组培养板置于 20-25°C 的温度下，培养五天后，读取这些培养皿并移至 30-35°C 的培养箱中培养 48 小时，或以此为基准进行变化。这种做法可确保同时检测环境细菌和真菌。这可能对菌落形态产生影响。同样，QC 人员应了解培养条件如何影响他们所监测的生物。这些知识使他们能够在选择培养基和培养方案时做出更好的决策，以优化可行微生物的回收率。

在 20-25°C 下，真菌生长在TSA 和 SDA 上呈现不同情况，并且在 TSA 上观察菌落更困难。

有效的监控不仅可以确保产品质量，而且在出现偏差或不合格时还可以作为关键的数据来源

培养时间的长短对于确保所有活体真菌生物的可见性非常重要。当真菌存在时，可能带来挑战的风险是，当 TSA 板移至 30-35°C 培养时，真菌生长速度会更快。 

霉菌在培养皿中蔓延，使得记录培养皿中细菌数量以及识别这些细菌的能力更加困难。这种挑战不仅限于暴露于双重培养的培养皿，真菌生长速度很快，当使用单次培养时，在 30-35°C 的培养皿中培养时，TSA 也面临同样的挑战。

监测洁净室中的霉菌生长

霉菌污染是洁净室环境中的一大问题。当 EM 板上出现霉菌时，可能会影响有效读取皿的能力。

例如，当培养皿培养 48 小时后，曲霉菌可能仅占据琼脂皿的一部分，但到第五天，它的生长就可以覆盖整个表面；这使得几乎不可能识别可能存在的任何细菌生长（图 3）。

图 3a -培养板-曲霉菌

图 3b - 培养皿 - 曲霉菌 4 天

与细菌一样，培养基的选择会影响霉菌的形态。在含有卵磷脂和吐温的 TSA 上，曲霉菌的生长速度比在标准 TSA 上更快，迅速覆盖培养皿并可能掩盖其他生物的存在。因此，在培养期间定期评估环境培养皿至关重要，以避免错过关键的污染事件。另一个重要的考虑因素是促进霉菌生长的环境条件。

强大的环境监测计划应能洞悉洁净室中存在的微生物类型

必须监测洁净室的湿度和温度，这两者都会影响真菌污染。如果湿度过高，即使采用严格的清洁和消毒规程，霉菌的生长也难以控制。监测和控制这些环境参数对于控制霉菌污染至关重要。

识别非典型生长模式

质量控制人员还必须能够识别由于 EM 期间的事故或偏差而导致的非典型生长模式。

例如，被操作员无意中掉落或触碰会呈现出异常的生长模式，并出现以前可能从未见过的生物。识别这些异常值对于正确解释和趋势分析 EM 数据非常重要，这样才能正确评估产品风险。 

例如，一块因意外接触而受到污染的培养皿可能会出现不规则的聚集增长，这与洁净室污染物典型的平滑均匀分布不同（图 4）。这些见解在调查超出趋势的结果时很有价值，有助于确保纠正措施有针对性和有效性。

图 4 - 培养板 - 不规则簇状生长

通过了解环境分离物的典型生长模式，微生物学家可以更容易地识别出何时出现趋势以外的情况，并确保没有遗漏任何内容。

培养基的选择以及培养时间和温度都很重要。这是为了确保当培养皿中没有细菌生长时，这真正表明产品没有环境风险，而不是由于生物生长所需的环境受到破坏而导致的假阴性结果。 

优化环境监测

有效的 EM 对于维持洁净室控制和确保产品质量至关重要。

了解菌落形态在不同培养条件下以及在各种培养基类型下随时间变化的能力对于识别污染物和防止污染至关重要。QC 人员必须具备准确解释 EM 数据的知识和技能，并考虑培养时间、培养基成分以及双重培养方案影响微生物恢复的可能性等因素。

在洁净室中，介质的选择对于污染物的回收起着至关重要的作用

通过优化微生物污染环境监测实践，洁净室可以得到控制，确保最终产品符合最高的质量和安全标准。通过仔细观察生长模式和菌落形态，可以更自信地恢复活菌，支持调查根本原因分析，并指导实施纠正措施以防止将来出现偏差。

在污染可能造成严重后果的行业中，这些实践对于维护洁净室环境的完整性和确保持续交付安全、高质量的产品至关重要。

作者：Shengyi
来源：拾西
公众号日期：2025年02月11日